植物组织培养

一、原理

植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。

愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。

二、试剂及仪器

（一）仪器设备

超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器（1-5ml）、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶（500ml、100ml）、量筒、烧杯（1000ml）、试剂瓶（1000ml、100ml）、长镊子、记号笔（或标签纸）、培养皿、酒精灯、打孔器

（二）试剂

75%酒精、次氯酸钠（或h2o2）、植物生长激素、蔗糖、脂粉、hcl、naoh、kh2po4、cocl2?6h2o、烟酸、盐酸-硫胺素（vb1）、盐酸-吡哆醇（vb6）、肌醇、甘氨酸

三、实验步骤

（一）培养基配制

1.培养基的选择

植物组织培养中应用的培养基，一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。

无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素：c、h、o、n、p、s、k、ca、na、mg等，微量元素：mn、zn、cu、b、mo、fe等。碳源一般为蔗糖。维生素中只有硫胺素是必需的，而烟酸、维生素b6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有iaa（吲哚乙酸）、iba（吲哚-3-丁酸）、naa（萘乙酸）、noa（萘氧乙酸）、p-cpa（对氯苯氧乙酸）、2，4-d（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-t（三氯苯氧乙酸）；bap（苄氨基嘌呤）、6-ba（苄基腺嘌呤）、2-zi（异戊烯氨基嘌呤）、kt（激动素)等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促进分化，但如培养基配方适当，则大多数组织是不需要的。

培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育，故应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。培养基种类繁多，最基本、最常用的培养基为ms培养基（见表1）。

2.培养基的配制

①先按表1配制ms培养基贮液，②再将贮液与其他成分按比例混合。③此外还需加入适量的蔗糖作为碳源，起支持作用的琼脂粉，适量的生长调节剂等。④将上述培养基加热溶解后，加蒸馏水使培养基达到终体积。⑤再用0.1mol/lnaoh或0.1mol/lhcl调节培养基的ph值至最适。⑥分装至三角烧瓶，封口膜封口，等待灭菌后使用。

3.几种诱导愈伤组织的培养基

胡萝卜ms+0.5mg/l6ba+0.5mg/lnaa

玫瑰叶盘，芽ms+0.5mg/l6ba+0.5mg/lnaa

烟草叶盘、叶柄ms+0.1mg/l6ba+0.5mg/lnaa

ph5.8，蔗糖30%，琼脂粉6.5g/l。

（二）灭菌

1．培养基及器具灭菌

培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为121℃，所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化（见表2）灭菌结束后待温度下降到50℃以下，才能取出已灭菌的培养基。

可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子、打孔器等。

2．工作环境灭菌

接种前1ｈ打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。

3.植物材料的灭菌

植株各部分的表面携带着各种微生物，他们是植物组培的污染源，所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒；组织内部侵染的真菌或细菌很难消除，这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用无菌洁净滤纸吸干水分。